聚酰胺-胺（PAMAM）树枝状大分子因其高度分支的三维结构、丰富的表面功能基团及良好的生物相容性，在药物递送、基因Treatment 和生物成像领域展现出独特优势。其中，末端氨基（NH₂）功能化的PAMAM（PAMAM-NH₂）通过化学修饰可实现多色荧光标记，为活体成像、细胞追踪及分子互作研究提供了高灵敏度、高分辨率的工具。

一、多色荧光标记的化学策略

1.1 异硫氰酸荧光素（FITC）标记

FITC是用于PAMAM标记的荧光染料之一，其异硫氰酸基团可与PAMAM-NH₂的伯胺基团发生特异性共价反应，形成稳定的硫脲键。标记过程通常在无水二甲基亚砜（DMSO）或乙醇溶剂中进行，通过控制FITC与PAMAM的摩尔比可优化标记效率。

1.2 近红外荧光染料标记

为满足活体深层组织成像需求，研究者开发了基于Cy5.5、Cy7等近红外染料的标记方案。以Cy5.5-NHS酯为例，其活性酯基团可与PAMAM-NH₂的氨基发生酰胺化反应，形成稳定的酰胺键。

1.3 双色/多色标记

通过分步标记策略，可构建同时携带两种或多种荧光染料的PAMAM-NH₂探针。例如，先以FITC标记PAMAM G4-NH₂的50%氨基，再以Cy5.5-NHS酯标记剩余氨基，获得FITC/Cy5.5双标记复合物。流式细胞术分析显示，该探针可同时被绿色（530nm）和红色（780nm）通道检测，且两种荧光信号强度呈正相关，证明标记过程未破坏PAMAM的分支结构。进一步引入量子点（QDs）或稀土上转换纳米颗粒（UCNPs），可拓展至三色甚至四色标记体系，满足复杂生物系统的多参数分析需求。

二、荧光标记PAMAM-NH₂的成像机制

2.1 细胞摄取与亚细胞定位

PAMAM-NH₂通过静电相互作用与细胞膜表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）结合，触发网格蛋白介导的内吞作用。标记后的PAMAM-NH₂-FITC在共聚焦显微镜下显示，其绿色荧光信号首先聚集于细胞膜，随后转移至早期内吞体，最终定位于溶酶体。通过与线粒体特异性染料共定位分析，可发现PAMAM-NH₂的氨基端基可通过破坏线粒体膜电位诱导细胞Apoptosis 。

2.2 活体成像与组织分布

近红外标记的PAMAM-NH₂-Cy5.5在活体成像中表现出良好的性能。在模型中，尾静脉注射后，荧光信号强度达到峰值。双标记探针可同步追踪载体在组织（Cy5.5通道）的动态变化，为药代动力学研究提供新方法。

2.3 分子互作可视化

PAMAM-NH₂的树枝状结构使其成为研究蛋白质-配体相互作用的理想平台。例如，将叶酸（FA）修饰于PAMAM G3-NH₂表面，再以FITC标记，可构建靶向叶酸受体（FR）的荧光探针。

三、PAMAM-NH₂多色荧光标记在成像中的应用

3.1细胞成像

PAMAM-NH₂的多色荧光标记在细胞成像中具有重要应用。通过将不同颜色的荧光标记物与细胞内的特定分子或结构结合，可以同时观察多个细胞组分的分布和动态变化。例如，可以使用绿色荧光标记细胞膜，红色荧光标记细胞核，从而在一次成像中清晰地观察到细胞膜和细胞核的形态和位置。此外，PAMAM-NH₂还可以用于标记细胞内的蛋白质、核酸等生物分子，帮助研究细胞内的信号传导通路和分子相互作用。

3.2组织成像

在组织成像中，PAMAM-NH₂的多色荧光标记可以用于标记不同类型的细胞或组织结构，从而实现对组织内多种成分的同时成像。

3.3活体成像

PAMAM-NH₂的多色荧光标记还可应用于活体成像。通过将荧光标记物注射到活体动物体内，可以实时观察标记物在体内的分布和代谢情况。例如，可以使用不同颜色的荧光标记物分别标记药物载体和药物分子，从而在活体成像中同时观察药物载体的分布和药物分子的释放情况。

3.4荧光共振能量转移（FRET）成像

荧光共振能量转移（FRET）是一种基于荧光标记物之间能量转移的成像技术，可用于检测分子间的相互作用。PAMAM-NH₂的多色荧光标记可以为FRET成像提供多种荧光标记物选择。通过将两个具有特定光谱特性的荧光标记物分别标记到两个相互作用的分子上，当这两个分子靠近时，会发生能量转移，从而产生可检测的荧光信号变化。这种FRET成像技术在研究蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用等方面具有重要应用。

PAMAM-NH₂的多色荧光标记技术在生物医学成像领域具有应用前景。它能够实现多种生物分子和细胞结构的同时标记和成像，为研究生物系统的复杂性和动态性提供了有力工具。然而，该技术也面临一些挑战，如荧光标记物的光稳定性、标记效率以及成像系统的分辨率等。