一. 产品简介

脂质纳米粒（Lipid nanoparticles，LNPs）转染试剂盒适用于将 DNA 或 RNA 分子（如 siRNA、mRNA、shRNA 等），亦可适用于活体动物的核酸转染以达到目的。其配方优化了转染效率，同时降低了细胞Poison 性，适用于多种细胞类型，包括贴壁细胞和悬浮细胞，为基因转染实验提供性能和可靠的结果。试剂盒内试剂均为无菌形式提供，无需额外灭菌处理，避免了使用过程中核酸酶解，制备得到的 LNP 转染试剂可直接应用于生物实验研究。本试剂盒提供两种灵活制备方式，既可通过移液器手动混合实现 LNPs 的快速小规模制备，也可配合微流控设备进行稳定、均一的大批量生产。

二. 试剂盒组成与存储 

三. 操作说明

1. 细胞培养

1) 贴壁细胞：以 24 孔板为例（其它培养板或培养皿可参考 24 孔板)：在转染前一天(18-24 小时)按照每孔约 10-20 万细胞(具体的细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度等而定)接种到 24 孔板内进行培养，使第二天细胞密度能达到约 60-80%。

2) 悬浮细胞：在即将制备复合物之前，用不含抗生素的培养基接种适量细胞。

实验前请确保：

细胞活力良好，处于对数生长期。

培养基：转染前更换为无血清、无抗生素培养基。

DNA或RNA要求：核酸为冻干粉或溶液均可；核酸为溶液时浓度需≥0.125μg/μL。DNA纯度（A260/A280处于 1.8~2.0 之间）；RNA 无 RNase 污染。

2. 手动法制备 LNPs 和转染细胞

按照下表手动制备 LNPs 并转染细胞：

代表性案例 1（核酸为干粉，以单个培养孔用量为例）

按上表步骤，为得到 10 μL 的 0.1 μg/mL 核酸/A 混合液，须向 1 μg 核酸中加入 10 μL A 液溶解，得到10 μL 的核酸/A 混合液（核酸浓度为 0.1μg/mL）。向混合液中加入 1 μL 的 B 液后，轻轻吹打 3 次，37 ℃孵育 30 min 得到 11 μL 的 LNPs。将培养孔内培养基换成 80 μL 的 Opti-MEM®培养基，加入 11 μL 的 LNPs后 37 oC 孵育 4-6 小时。之后，再将培养孔内培养液换成 Opti-MEM®培养基，继续培养 12-18h 即完成转染。

代表性案例 2（核酸为 0.125 μg/mL 溶液，以单个培养孔用量为例）

按上表步骤，为得到 10 μL 的 0.1 μg/mL 核酸/A 混合液，须向 8 μL 核酸溶液（0.125μg/mL）中加入 2 μL A 液进行稀释，得到 10 μL 的核酸/A 混合液（核酸浓度为 0.1μg/mL）。向混合液中加入 1 μL 的 B 液后，轻 轻吹打 3 次，37 oC 孵育 30 min 得到 11 μL 的 LNPs。将培养孔内培养基换成 80 μL 的 Opti-MEM®培养基， 加入 11 μL 的 LNPs 后 37 oC 孵育 4-6 小时。之后，再将培养孔内培养液换成 Opti-MEM®培养基，继续培养 12-18h 即完成转染。

代表性案例 3（核酸为 1 μg/mL 溶液，以单个培养孔用量为例）

按上表步骤，为得到 10 μL 的 0.1 μg/mL 核酸/A 混合液，须向 1 μL 核酸溶液（1 μg/mL）中加入 9 μL A 液进行稀释，得到 10 μL 的核酸/A 混合液（核酸浓度为 0.1μg/mL）。向混合液中加入 1 μL 的 B 液后，轻轻吹打 3 次，37 oC 孵育 30 min 得到 11 μL 的 LNPs。将培养孔内培养基换成 80 μL 的 Opti-MEM®培养基，加入 11 μL 的 LNPs 后 37 oC 孵育 4-6 小时。之后，再将培养孔内培养液换成 Opti-MEM®培养基，继续培养 12-18h 即完成转染。

3. 微流控法制备 LNPs

使用微流控芯片代替手动制备 LNPs 时，请采用鱼骨芯片（芯片结构如下图）。在完成 Step 2 之后，将核酸/A 混合液与 B 液分别连接至微流控两根进样管道，控制核酸/A 混合液：B 液进样流速比为 10：1，总流速≥0.1 mL/min。本试剂盒配方已经过优化，得到的 LNPs 无需透析和超滤等纯化步骤。按照前面同样的操作流程进行细胞转染。

四. 注意事项

建议在无菌条件下操作，避免引入外源核酸酶导致核酸降解失活。

B 液保存在 4℃干燥环境，使用前平衡至室温，使用过程中需避免长时间敞口，使用后需要密封好保存。

由于 B 液含乙醇，制备得到的 LNPs 原液中乙醇含量<10%，经培养基稀释后乙醇含量降低至<1%。因 此，本试剂盒制备得到的 LNPs 可以不需要纯化处理直接使用，少量乙醇并不会明显影响细胞生长。若 需要去除乙醇，可通过超滤（步骤如下）或者透析去除。

超滤步骤：向产物溶液添加 4 倍体积的 A 液进行稀释，置于 3 kD 超滤管中，3000-5000 g 离心 10-15 min， 浓缩至原体积的 1/4。向超滤管中添加 pH=7.4 的无酶 PBS 或 Tris-HCl （10 mM）再次超滤，浓缩至原 体积 1/4，重复该步骤 2-3 次，使乙醇含量降低至 0.5%。最后将溶液储存在 4℃，可保存 2-3 周。请勿将产物储存在-20℃或-80℃！

核酸/A 混合液：B 液约为 10 : 1（体积比）。当核酸分子量较大时，可能会影响 LNPs 转染试剂稳定性，此时可增加 B 液用量，使得核酸/A 混合液：B 液为 10 : 2（体积比）。

对于某些半衰期比较长的目的基因需要在转染后 3-5 天，才能检测到 RNA 或蛋白水平的下降。因细胞类型不同和培养条件差异，最佳的转染条件（试剂用量、转染时间等）会存在差异，可以在上述推荐用量基础上再优化用量，以获得最佳转染条件。 Ø

以 24 孔板为例 293T 细胞转染 24h 的效果图：