NHS-N3，即活性酯 - 叠氮，是一类重要的聚乙二醇衍生物，在蛋白质修饰领域应用较广。它结合了 NHS 活性酯和叠氮基团（-N₃），独特结构赋予其特殊性质，为蛋白质修饰提供了有效途径。

蛋白质由氨基酸组成，赖氨酸残基的侧链氨基以及蛋白质 N 末端的游离氨基，均为蛋白质修饰提供了活性位点。NHS-N3 修饰蛋白质，主要基于两种化学反应：NHS 活性酯与蛋白质伯胺基团的反应、叠氮基团参与的点击化学反应。

图为：NHS-N3结构式

在中性至弱碱性条件（pH 7~8.5）下，NHS 活性酯易与蛋白质中的伯胺基团（-NH₂）发生亲核取代反应，生成稳定的酰胺键，从而将 PEG 链连接到蛋白质上。此过程中，NHS 作为离去基团脱离，使蛋白质与 NHS-N3 形成共价结合。通过该反应，可实现蛋白质的 PEG 化修饰，这不仅能提高蛋白质在溶液中的溶解度，减少其聚集，还能降低蛋白质的免疫原性，延长其在体内的循环时间。例如，在某些蛋白质药物的研发中，PEG 化修饰后的蛋白质药物能减少被免疫系统清除的几率，提高Therapeutic effect 。

叠氮基团（-N₃）则可与含炔基的化合物，在铜催化下于水溶液中发生点击化学反应，生成稳定的三唑环结构。若将蛋白质先与 NHS-N3 通过 NHS 活性酯与伯胺的反应连接，再利用叠氮基团与含炔基的功能分子进行点击反应，就能进一步引入具有特定功能的分子，实现蛋白质的多样化修饰，增强蛋白质的功能。

图为：nhs结构式

实验操作时，首先要对蛋白质进行预处理，用不含伯胺的缓冲液（如 PBS）进行透析或脱盐，以去除可能干扰反应的杂质。将蛋白质溶解于合适的缓冲液，调整浓度至合适范围。同时，将 NHS-N3 溶解于有机溶剂（如 DMSO 或 DMF），现用现配，防止 NHS 活性酯水解。将 NHS-N3 溶液缓慢加入蛋白质溶液中，保证 NHS-N3 与蛋白质中伯胺基团的摩尔比在 10~50 倍，以确保反应充分。在室温下搅拌反应 30~60 分钟，或 4℃反应 2 小时，反应期间需注意避免溶液挥发。反应结束后，采用尺寸排阻色谱或透析等方法对修饰后的蛋白质进行纯化，去除未反应的 NHS-N3 和其他杂质，即可得到修饰后的蛋白质产物。

NHS-N3 为蛋白质修饰提供了有效的手段，通过准确控制反应条件和步骤，能实现对蛋白质的高效、特异性修饰，为蛋白质在生物医学、生物技术等领域的应用开拓了广阔前景。